Effetti dell’estratto di giovani foglie d’orzo e delle vitamine antiossidanti sul processo di ossidazione di LDL e sull’attività di distruzione dei radicali liberi in soggetti con diabete di tipo 2

Y.-M. YU (1,3), W.-C CHANG (2), C.-L HSIEH (2), C.E. TSAI (3)

RIASSUNTO

Scenario: E’ stato esaminato, su un campione di pazienti diabetici di tipo 2, l’effetto di una supplementazione nutrizionale con estratto di giovani foglie d’orzo (BL) e/o vitamine antiossidanti C ed E sulle varie frazioni di lipoproteina a bassa densità (LDL) predisposte all’ossidazione e sull’attività di distruzione dei radicali liberi.

Metodi: Sono stati iscritti a questo studio 36 pazienti diabetici di tipo 2. I soggetti, divisi in gruppi, hanno ricevuto ogni giorno, per 4 settimane, uno dei seguenti supplementi nutrizionali: gruppo BL 15 gr. di estratto di giovani foglie d’orzo, gruppo CE 200 mg. di vitamina C e 200 mg. di vitamina E, gruppo BL+CE una combinazione di estratto d’erba d’orzo e vitamina C e E.

Risultati: I livelli nel sangue di Lucigenin-Chemiluminescenza e Luminol-Chemiluminescenza si sono ridotti significativamente in tutti i gruppi di pazienti. Dopo la cura, specialmente nel gruppo BL+CE i miglioramenti sono stati notevoli: la vitamina E contenuta nelle frazioni di LDL è aumentata notevolmente, la percentuale di maggiorazione dell’intervallo di ossidazione era molto più alta che nei gruppi BL o CE singoli, l’effetto antiossidante è stato più alto nella particella di Sd-LDL, con ulteriori aumenti in percentuale del tempo di latenza superiori di quattro volte se confrontiamo l’integrazione solo con erba d’orzo.

Conclusione: I nostri risultati indicano che l’integrazione nutrizionale con erba d’orzo può aiutare a distruggere i radicali liberi, salvare il contenuto di vitamina E nell’LDL, e impedire l’ossidazione di LDL. Inoltre l’aggiunta di vitamina C e E all’erba d’orzo può impedire maggiormente l’ossidazione di Sd-LDL, attività che protegge i pazienti diabetici di tipo 2 da malattie vascolari.

INTRODUZIONE

Rispetto alla popolazione sana i diabetici hanno un alto rischio di sviluppare l’arteriosclerosi periferica e le malattie alle arterie coronariche. I pazienti diabetici di tipo 2 spesso hanno livelli elevati di Triglicerolo (TG) e particelle di LDL piccole e dense (Sd-LDL), insieme a livelli più bassi di colesterolo HDL. Le particelle di Sd-LDL (d=1.040 -1.054 g/ml) sono più suscettibili di ossidazione rispetto alla più grande LDL (B-LDL) perché la loro capacità di essere trattenute nelle pareti arteriose è maggiore delle particelle lipoproteiche più grandi. Un alto livello di zucchero nel sangue è comunemente associato ad aumenti di ossidazione nelle particelle di LDL. In più, i cambiamenti metabolici, causati da iperglicemia, includono un continuo aumento del flusso ciclico dei polioli, elevata formazione di radicali liberi ed elevata glicosilazione. Sembra che tutti questi fattori accelerino il processo di emolisi dei globuli rossi e quello di ossidazione del plasma LDL. In alcuni precedenti studi clinici si è dimostrato che l’LDL di alcuni pazienti diabetici era più soggetto all’ossidazione, ciò era dovuto probabilmente a livelli di a-tocoferolo più bassi del normale. Ma il risultato è ancora controverso. La supplementazione con vitamina E può triplicare l’intervallo del tempo di ossidazione di B-LDL piuttosto che in quello di Sd-LDL. Perciò, nel corso dell’integrazione con antiossidanti, l’Sd-LDL può procurare minore protezione contro l’ossidazione rispetto a B-LDL. Nei pazienti diabetici di tipo 2, questa condizione contribuisce ad un aumento delle malattie cardiache e di altre malattie vascolari.
In un indagine del 1995 è stato individuato che l’aumento di contenuto di antiossidanti nella dieta e nel sangue, come la vitamina C e/o la E, contribuisce a diminuire i fattori di rischio delle malattie cardiovascolari. Altri studi hanno dimostrato che assumere contemporaneamente la vitamina C ed E riduce fortemente i rischi di malattie cardiovascolari piuttosto che la loro assunzione singola.
L’estratto di giovani foglie d’orzo (BL) è una risorsa naturale di vitamine e minerali. Esso contiene composti polifenolici ed è stato dimostrato che ha proprietà antiossidanti nel sistema di perossidazione dei lipidi.
La ricerca di seguito esposta è stata condotta per determinare gli effetti dell’integrazione alimentare con l’estratto di giovani foglie d’orzo (BL), le vitamine C ed E, una combinazione di BL + vitamina C e E sui grassi presenti nel sangue. Inoltre è stata studiata, nei pazienti diabetici di tipo 2, la predisposizione all’ossidazione di alcune unità di LDL e l’attività di distruzione dei radicali liberi.

METODI E MATERIALI

Soggetti
Attraverso una selezione causale sono stati selezionati 36 pazienti con diabete di tipo 2 (plasma del glucosio > 7.7 mmo1/L, Hba 1c > 6%) appartenenti alla clinica diabetica dell’Istituto Cinese di Medicina di Taichung a Taiwan. Sono stati esclusi da questo studio i pazienti con complicazioni diabetiche, ovvero soggetti con proteinuria (proteina nelle urine), alterazione del fondo dell’occhio, neuropatologie e malattie del fegato.
Nessuno dei soggetti selezionati aveva gravi problemi medici e nessuno di questi prendeva farmaci per abbassare il colesterolo, vitamine o altri antiossidanti. L’iperglicemia è stata controllata con la dieta (contenente 10-15% proteine, 30% grassi, 55-60% carboidrati) e con agenti orali (glipizide o gliburide). Durante la ricerca non è stata introdotta nessuna modifica nel trattamento dell’iperglicemia. Tutti i soggetti erano volontari e hanno firmato il consenso. Il protocollo è stato approvato dalla Commissione Ricerche Accademiche dell’Istituto Cinese di Medicina.
I 36 soggetti sono stati divisi casualmente in 3 gruppi: BL, CE, BL+CE.
Al gruppo BL è stato somministrato 15 gr./d di estratto d’erba d’orzo (fornita da Yoshihide Hagiwara Products Co., Oxnard, California, USA). Al gruppo CE è stato somministrato 200mg/d di vitamina C e 200 mg/d di vitamina E (fornita da Jen Shen Pharmaceutical Co., Taichung, Taiwan). Al gruppo BL+CE è stato somministrato 15 gr./d di estratto d’erba d’orzo più 200 mg/d di vitamina C e 200 mg/d di vitamina E.
L’estratto d’erba d’orzo conteneva sostanze antiossidanti come il betacarotene (24.962 IU/100gr), la vitamina C (100 mg/100gr), la vitamina E (10.8 mg a-tocoferolo/100 gr) (Analisi condotta da YH Products CO.) e composti polifenolici (291.6 mg acido gallico/100 g).
Ai pazienti, prima di iniziare l’esperimento, è stato dato un programma alimentare dettagliato insieme alla precauzione di non assumere vitamine o mangiare fuori pasto. Il trattamento è iniziato alla settimana 0, dopodiché è iniziato il programma alimentare e si è terminato alla settimana n. 4.

Identificazione del contenuto totale fenolico
Il contenuto totale dei fenoli è stato identificato seguendo il metodo Taga et al. (1984) e calcolato, seguendo la procedura standard, usando l’acido gallico (Sigma Chemical Co., Montana, USA). Sono stati estratti 10 grammi di erba d’orzo da 200 mL di metanolo che è stato poi depositato in una provetta e filtrato. Il metanolo filtrato è stato fatto evaporare e dissolto in una soluzione di metanolo/acqua (60;40, 0,3% HCI) allo scopo di portare la concentrazione finale a 50 mg/mL. Alla soluzione risultante (100 pL) è stata aggiunta 2 mL di 2% Na2CO3. Dopo 2 minuti a questa soluzione è stata aggiunta 100 mL di soluzione di reagente Folin-Ciocalteu (50%) che venne lasciata riposare per 30 minuti. L’assorbenza è stata misurata a 750 nm usando uno spectofotometro. I risultati sono stati espressi in milligrammi per grammi di acido gallico/100 g di polvere di estratto d’erba d’orzo.

Prelievo del sangue e analisi
Dopo 12 ore dall’inizio del trattamento e fino alla fine delle 4 settimane della supplementazione con gli antiossidanti sono stati prelevati dai pazienti alcuni campioni di sangue venoso. Il sangue è stato centrifugato a 1000 x g per 15 minuti a 4 (C per ottenere il plasma. Concentrazioni di plasma TG furono ottenute da un test enzimatico GPO_PAP attraverso l’uso di un kit enzimatico in commercio (Merk Ltd, Darmastadt, FRG). Le concentrazioni di plasma e colesterolo sono state misurate da un test enzimatico in commercio CHOD-PAP. Le concentrazioni di glucosio sono state determinate con un test Uv enzimatico GDH, usando un kit in commercio (Roche Product Co., Ontario, canada). L’Emoglobina Alc (HbA 1c) è stata misurata con un cromatografo liquido (HLC-723 Ghb Modello II Analyzer). Il valore di riferimento per l’HbA1c andava da 3.4% a 5.8%.

La fase di intervallo dell’ossidazione di LDL
Le particelle di B-LDL (d=1.022-1.032 g/ml) e di Sd-LDL sono state isolate con l’uso di micro-ultracentrifugati in soluzioni NaBr-NaCI, come descritto in precedenza.
L’ossidazione LDL è stata rilevata dopo dialisi notturna con PBS in isolamento di 48 ore.
L’ossidazione di LDL è stata determinata attraverso la produzione di dieni coniugati con il continuo monitoraggio dei cambiamenti nell’assorbenza a 234 nm. La formazione di dieni coniugati è stata misurata attraverso l’incubazione di 50 mg di LDL con 5 umol/L di solfato di rame (Cu++) in 1 mL PDS ad una temperatura di 37°. Gli intervalli sono stati determinati dal tempo di formazione di dieni coniugati durante l’ossidazione di Cu++ mediata di LDL. La durata della fase di intervallo è stata determinata dal tempo (in minuti) di intercettazione della tangente della curva di assorbenza nella fase di propagazione con baseline. .A234nm è il valore massimo di assorbenza.
Il tasso di propagazione è stato espresso/a dall’inclinazione della tangente (cambiamenti nell’assorbenza/min).

La lipoproteina vitamina E
La vitamina E è stata misurata con il cromatografo liquido (HPLC) seguendo il metodo Kaplan et al. Per determinare il contenuto di vitamina E nell’LDL è stata usata 200 uL aliquota di LDL e aggiunto 5ug a-tocoferolo acetato, cosi come prevedeva lo standard interno. L’LDL è stato estratto con etanolo e seccato sotto nitrogeno. La sostanza estratta è stata reidratata con una fase mobile che consisteva di acetonitrile: tetrahydrafuran (70:30, V:V) e viaggiava ad una velocità di 1 mL/min. L’analisi cromotografica è stata eseguita con un LiChroCART 250-4 Purospher RP-18 (5um)n column (Merk Ltd, Darmastadt, FRG) e monitorata a 292 nm con un Uv detector (LC-400, Hitachi, Giappone). I calcoli sono stati definiti attraverso un confronto delle proporzioni delle aree di picco della curva standard seguendo l’esempio degli standard interni.

Misura in vivo dei radicali liberi
Un’amplificata Lucigenin e Luminol-Chemiluminescenza è stata utilizzata per quantificare nel sangue i radicali superossidi e i radicali liberi dell’ossigeno. Il metodo di misurazione di luminol-CL o lucigenin-CL è stato simile a quello descritto in precedenza. Il valore totale dei conteggi sono stati calcolati attraverso l’integrazione dell’area sotto la curva e sottraendola dal livello più basso. La produzione di CL per globuli bianchi (WBC) è stata calcolata attraverso la divisione dei livelli di CL nel sangue con il conteggio di WBC ed espresso in CL/WBC.

Analisi statistica
Tutti i dati sono stati espressi in Mean+Sd.
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite usando GB-STAT (versione 5.0; Dynamic Microsystems, Inc., USA). I confronti sono stati fatti con one-way ANOVA fra i diversi gruppi. Il risultato successivo al Test di Turkey è stato usato per analizzare gli effetti più significativi. Student-T-test comparati sono stati usati per determinare le differenze tra i valori da 0 a 4 settimane, prendendo in considerazione le variabili B-LDL e Sd-LDL tra i due gruppi. Inoltre è stato applicato un segmento di blocco casuale a 2 fattori per poter valutare gli effetti dei trattamenti sulle diverse sottounità LDL tra e all’interno i gruppi. I gruppi BL, CE e BL+CE sono stati trattati indifferentemente. I valori di B-LDL e Sd-LDL sono stati trattati come blocco casuale a 2 fattori. Ai fini statistici è stato preso in considerazione un valore P di 0,05.

RISULTATI

Caratteristiche dei soggetti
35 dei 36 partecipanti hanno completato l’esperimento. Uno dei soggetti selezionati, facente parte del gruppo della vitamina CE, si è ritirato a causa di problemi personali. Le caratteristiche dei partecipanti sono mostrate nella Tabella I. Non ci sono state particolari differenze fra i gruppi in termini di età, indice di massa corporea, HbA1c, plasma glucosio oppure durata del diabete.

Plasma glucosio e grassi
Nella tabella II vengono presentati i valori di plasma glucosio, grassi e lipoproteine nel sangue. Dopo l’integrazione con antiossidanti non ci sono stati cambiamenti rilevanti sui livelli di glucosio, HbA e TG, eccetto che per una riduzione di TG nel gruppo CE. I partecipanti di tutti i gruppi hanno avuto significanti riduzioni dei livelli totali di colesterolo nel sangue (TC) e di LDL-C. Comunque, non ci sono state altre riduzioni di TC o LDL-C nel sangue dei pazienti del gruppo BL + CE se confrontiamo i risultati con il gruppo BL.

Effetti sulla predisposizione di LDL all’ossidazione
Nella Tabella III vengono presentati i dati sulla predisposizione di LDL all’ossidazione.
La supplementazione con gli antiossidanti ha verificato un aumento significativo dei livelli di vitamina E contenuta in B-LDL e Sd-LDL.
Ci si è accorti che i contenuti di vitamina E sia in B-LDL che in Sd-LDL sono stati più alti nel gruppo BL+CE piuttosto che nel gruppo BL o CE. L’intervallo di ossidazione di Sd-LDL della settimana 0 è stato più breve di quello di B-LDL. L’intervallo di B-LDL e Sd-LDL è aumentato significativamente alla 4° settimana se lo confrontiamo con la settimana 0 in tutti e tre i gruppi. In più, l’intervallo del gruppo BL+CE è stato più lungo di quello del gruppo BL o CE. Non si è invece modificata la velocità di riproduzione .A234nm. La percentuale di aumento dell’intervallo nel gruppo BL è stata per lo più la stessa di quella del gruppo delle vitamine C e E (fig. 1). La percentuale di incremento del periodo di ritardo nel gruppo che ha assunto l’erba d’orzo più la vitamina C e E è stata significativamente più alta (rispettivamente 86±9,3% nel B-LDL, 177.1±8.1% in Sd-LDL) di quella del gruppo a cui è stata somministrato l’erba d’orzo (BL) (rispettivamente 47.8±4.4% nel B-LDL, 39.9%±9.7%nel Sd-LDL) oppure nel gruppo a cui è stata somministrato solo la vitamina C e E (49.8%±7.3% nel B-LDL, 65±8,5% nel Sd-LDL).
L’effetto antiossidante del gruppo BL+CE è stato maggiore per Sd-LDL (177,1±8,1%) con l’aumento della percentuale di 4 volte del tempo di latenza paragonato solamente a BL (39,9±9,7%) (fig. 1).

Fig. 1 e Fig. 2 Vedi allegato A

Effetti sull’attività di distruzione dei radicali liberi
I livelli di lucinegin-CL del sangue si sono ridotti notevolmente dopo 4 settimane di integrazione nutrizionale con erba d’orzo o vitamina C e E (29.4±8.7% o 40.8±24.0%). Per il gruppo BL+CE la riduzione corrispondente è stata 38.6±7.1% (P<0.05) (Fig. 2). Questo risultato ci suggerisce che l’integrazione alimentare con erba d’orzo oppure vitamina C e E riduce la produzione di radicali superrossidi. Ma una combinazione di erba d’orzo, vitamina C e E potrebbe non migliorare questa riduzione. Anche i livelli di luminol-CL del sangue si sono notevolmente ridotti: 66.6±26.6%, 53.4±20.1% e 65.4±11.4% rispettivamente, dopo 4 settimane di integrazione nutrizionale, nel gruppo erba d’orzo (BL), in quello della vitamina C e E (CE) o in quella con entrambi (BL+CE)(Fig. 3). Questi risultati indicano che la produzione di radicali liberi provenienti dai leucociti periferici del sangue si è ridotta notevolmente dopo l’integrazione con gli antiossidanti. Tuttavia, è stato osservato che la combinazione di questi 2 tipi di antiossidanti non ferma l’aumento della produzione dei radicali liberi.

DISCUSSIONE

Questo studio ha messo in evidenza che l’integrazione per 4 settimane sia con 15g/d di erba d’orzo o vitamina C (200mg/d) e E (200mg/d) riduce notevolmente i livelli di colesterolo nel sangue (TC) e LDL-C. Un risultato simile segnalato anche da Khajehdebi (Khajehdebi – Effect of vitamin on the lipid profile of patients on regular hemodialysis. Scand j Urol Nephrol, 200. 34, 62-66) dimostra che la vitamina C (200 mg) e la vitamina E (200 mg) riducono il colesterolo e LDL-C nella stessa proporzione in cui si riducono i livelli di LDL-C/HDL-C in pazienti sottoposti a emodialisi. Anche se l’efficacia della vitamina C e E nel ridurre i grassi nel sangue rimane ancora controversia, i nostri risultati sostengono che questi antiossidanti hanno proprietà ipocolesterolemiche (Tabella II). Inoltre, nel gruppo che ricevette l’erba d’orzo insieme alla vitamina C e E non si sono verificati ulteriori riduzioni nei livelli di plasma TLC.
Il nostro studio ha anche esaminato gli effetti della sola assunzione di erba d’orzo, che nei pazienti diabetici di tipo 2 non è mai stato esaminato in vivo, o con altri antiossidanti soggetti ad ossidazione dell’LDL.
Le valutazioni di questi interventi in soggetti diabetici di tipo 2 sono particolarmente importanti perché il loro LDL è frequentemente più ricco di particelle di Sd-LDL, più predisposto all’ossidazione e con maggiori possibilità di formazione di radicali liberi nel sangue.
Nei sistemi biologici la causa della formazione dei radicali liberi dell’ossigeno può essere dovuta ai radicali superossidi, al perossido d’idrogeno oppure ai radicali hydroxyl. Il Luminol-CL è stato usato come indicatore ultrasensibile della produzione di radicali liberi dell’ossigeno. Lucinegin-CL reagisce più specificatamente con anioni superiossido che sono stai creati nei leucociti da NADP ossidasi.
I nostri risultati hanno dimostrato che l’integrazione nutrizionale con erba d’orzo oppure con le vitamine C e E riducono i livelli di radicali liberi dell’ossigeno presenti nel sangue.
Ciò significa che l’erba d’orzo agisce come distruttore di radicali liberi. Non sono stati osservati ulteriori riduzioni nel gruppo BL+CE. L’abilità alla distruzione dei radicali liberi può derivare dalla struttura polifenolica dell’erba d’orzo.
Precedenti ricerche hanno dimostrato che nei pazienti diabetici di tipo 2 l’integrazione con vitamina E prolunga il tempo di ossidazione di B-LDL maggiormente che nel Sd-LDL. Perciò la Sd-LDL può risultare meno protettiva contro l’ossidazione di vitamina B del B-LDL. Combinazioni di più antiossidanti sono importanti al fine di fornire l’LDL della giusta protezione dall’ossidazione. I nostri risultati hanno dimostrato che la combinazione di erba d’orzo con le vitamine C+E può prolungare il tempo di ossidazione di B-LDL dell’86±9.3%, e di 177.1±8.1% di Sd-LDL.
Quindi, il beneficio della combinazione BL+CE è stato migliore per l’Sd-LDL , con 4 punti di aumento nel tempo se confrontato con la somministrazione di solo erba d’orzo (Fig. 1).
Per concludere, l’integrazione nutrizionale con erba d’orzo riduce i livelli di TC nel sangue. La percentuale di aumento dei tempi di ossidazione nel gruppo BL+CE è significativamente più alta rispetto ai quelli del gruppo BL o CE. Un notevole effetto antiossidante si è verificato nel Sd-LDL nel gruppo BL+CE. Fu anche osservato che l’erba d’orzo produceva una diminuzione di lucinegin-CL e luminol-CL nel sangue. Questi risultati ci portano alla considerazione che l’erba d’orzo impedisce la formazione di radicali liberi. Quindi l’integrazione nutrizionale con erba d’orzo combinata con vitamine antiossidanti può ridurre i maggiori fattori di rischio dell’arteriosclerosi. Questo può proteggere i pazienti diabetici di tipo 2 dalle malattie vascolari.

Ringraziamenti
La ricerca è stata sostenuta grazie all’aiuto del National Science Council di Taiwan.

C.E. Tsai, Dipartimento di Nutrizione e Scienza dell’Alimentazione, Università di Fu Jen, Taipei 24205, Taiwan.
E-mail jtasi@mails.fju.edu.tw
Ricevuto: 12 Marzo 2001; Revisionato: 26 Novembre 2001

(1) Dipartimento di Nutrizione
(2) Scuola di Medicina, Università di Medicina Cinese, Taichung, Taiwan
(3) Dipartimento di Nutrizione e Scienza dell’Alimentazione, Università di Fu Jen, Taipei 24205, Taiwan

Torna alla Pagina Precedente